鸽形目性别核酸检测试剂盒（带内参，PCR-荧光探针法）  

本试剂盒可对鸽的羽毛、血液及组织等样品中CHD-W保守基因进行扩增检测，进而对鸽的性别进行鉴定。通过引入内源性内参可对核酸提取和扩增过程进行监测，确保检测结果的准确性。  

产品内容：  

储存条件：  

-20℃条件下保存，有效期至少12个月。  

实验操作：  

1. 样本制备（样本制备区）  

1.1样本要求：  

羽毛：采集胸部、腹部或腿部羽毛（含羽根部分）不少于5根，切勿使用自然脱落的羽毛。  

全血：使用EDTA作为抗凝剂，切勿使用肝素抗凝，要求使用新鲜全血，或在2~8℃不超过7天，或在-20℃条件下保存不超过3个月，应尽量避免反复冻融。  

组织：采取新鲜肌肉或器官组织（尽可能不使用皮或者筋膜等不易处理样本）不超过100mg，使用200-500μL无菌水制备组织匀浆液，再进行后续样本制备。  

1.2样本制备：  

请参照三狮生物《动物基因组DNA快速提取试剂盒（PCR分析用）说明书》（货号：DP202），或其他符合相关要求的核酸提取试剂盒/方法，对处理后的样品进行核酸提取。提取的样品核酸放置于冰盒中，并尽量及时进行检测，4℃保存不超过7天或-20℃保存不超过6个月。  

2. 配制反应体系（加样区）  

2.1  取出试剂盒中各组分，室温条件下完全解冻，离心10秒，将管壁和管盖内的液体离心至管底；按样本数量（n+2）（即n个待检样本+1个阳性对照+1个阴性对照）配制反应体系，具体配制方法如下：分别吸取（（n+2）× 11.5µL GW反应液+（n+2）× 11.5µL GW预混液）加入洁净离心管中，移液器吹吸充分混匀，分装至PCR管中，每孔23μL，放在冰盒中备用。  

2.2 然后向反应液中依次添加2μL阴性对照、提取的样本核酸和GW阳性对照，盖好管盖，做好记录，每个反应总体积为25μL。充分混匀，离心10秒后在PCR仪上进行扩增实验。  

3. PCR扩增（扩增及产物分析区）  

95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，58℃退火延伸30秒，35个循环，在58℃时收集荧光信号。荧光第一通道选择FAM（CHD-W基因），第二通道选择VIC/HEX（内源性内参基因）（使用ABI系列实时荧光定量PCR仪，若有需求可提前联系厂家或自行添加ROX校正染料；否则参照正常程序进行）。   

4. 结果判定  

4.1 阳性对照FAM通道和VIC/HEX通道的Ct值均＜28且出现“S”型扩增曲线，阴性对照无Ct值或Ct值≥35且无“S”型扩增曲线，实验结果有效；否则应重新进行实验，如重测实验仍无效，请与厂家技术人员联系。  

4.2 样本VIC/HEX通道的Ct值应≤30且出现“S”型扩增曲线，表明样本提取和扩增有效；如VIC/HEX通道无Ct值或Ct值为30＜Ct≤35，表明样本核酸提取不达标或存在较强抑制干扰物（如酒精等消毒剂、抗凝剂等残留）抑制扩增，建议重新处理样本进行核酸提取及扩增；  

4.3 样本VIC/HEX通道检测有效后，再进行FAM通道的判定：  

Ct值≤30且出现“S”型扩增曲线，判定为CHD-W基因阳性，表明样本来源于雌性；  

Ct值为30＜Ct＜32，则均判定为可疑，建议进行复测（建议先排除环境气溶胶污染导致的“假阳性”结果，再重新进行核酸提取及检测），如排除气溶胶污染后FAM通道复测Ct值＜30，且有明显的扩增曲线，判定为CHD-W基因阳性，否则判定为阴性；  

无Ct值或Ct值≥32且无“S”型扩增曲线，判定为CHD-W基因阴性，表明样本可能来源于雄性。  

注意事项：  

1）为了防止污染，实验需要严格进行分区操作，分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成交叉污染。实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。PCR结束后，切勿立即开盖，充分冷却后再开盖取样，最大程度避免气溶胶污染。  

2）试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融。试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求进行操作。操作台、离心机及移液器等仪器应定期使用含氯消毒剂、消毒酒精、核酸污染清除剂或紫外灯进行消毒。  

3）检测结果为阴性，并不完全代表为雄性，核酸样本发生未知突变、质量不合格、载量过低、存在较强干扰抑制物导致核酸提取（检测）不成功亦会产生“阴性”结果。本试剂盒仅用于鸽中CHD-W基因的特异性扩增，涉及的其他产品请详询生产厂家。  

4）本品为一次性用品，试剂中的组分对于自然光较为敏感，分装及保存时注意遮光，请勿反复冻融，仅供科学研究，不用于临床诊断等其他用途。